La seconda cappella è dedicata alla Vergine Immacolata.Stilisticamente uguale alle altre, ha una storia liturgica che va dal XV al XVIII secolo.Un altare infatti dedicato all'immacolata esisteva nella chiesa del convento fuori le mura della città.Lo stesso altare fu eretto nella Chiesa costruita dentro le mura, dopo il 1528.Nella Cappella dell'Immacolata nella chiesa cinquecentesca vi era il quadro dell'Immacolata che oggi si ammira sulla parete sinistra della Cappella del Rosario (m 3.45x2.12).Il quadro è datato 1588, e l'autore è da ricercarsi tra i pittori attivi in S.Francesco tra 1570 ed il 1590.
Nella chiesa attuale la Cappella dell'Immacolata è situata in una cappella grande dalla parte del corno evangelico dell'Altare Maggiore, e cioè proprio di fronte alla Cappella di S.Francesco d'Assisi.L'altare è tutto fatto in pietra e lavorato in stucco.
Qui è custodita la statua dell'Immacolata ritagliata da mastro Brudaglio di Andria.Nella stessa Cappella sono presenti anche due tele, di cui una rappresentante Cristo Madonna e S.Francesco (m 2.40x1.67) datata 1755 e l'altra rappresenta S.Chiara con ostensorio e clarisse (m 2.40x1.59).Entrambe le tele appartengono a Vincenzo Fato.