Nel 1480 il Moro, pur continuando a chiamarsi duca di Bari, era praticamente il vero duca di Milano. Intanto a Napoli nel 1489 si dava atto al matrimonio programmato già da tempo tra Isabella d’Aragona e GianGaleazzo Sforza. Da questo matrimonio Isabella ebbe Francesco, Ippolita, Bona e Bianca (quest’ultima però morì nel 1496 o 1497). Non ancora venticinquenne moriva GianGaleazzo : in mezzo a diffuse dicerie che fosse stato avvelenato per ordine del Moro, e quest’ultimo si fece proclamare fulmineamente duca di Milano. Poco dopo faceva trasferire Isabella, sua principale contendente, nel castello sottoponendola a stretta sorveglianza. Il Moro infatti aveva conosciuto Isabella prima ancora della morte di suo nipote, a Napoli quando, mal tollerato da Simonetta, si era rifugiato presso Ferdinando. Qualcuno ritiene quindi che il Moro si fosse innamorato di Isabella e che da questa respinta, si sarebbe in seguito vendicato con una diabolica azione persecutoria contro di lei. A Napoli il Moro conobbe la cugina di Isabella, Beatrice d’Este, che in seguito divenne sua sposa. A Milano Isabella si rese conto subito della situazione : il Moro infatti reggeva da otto anni il ducato e non mostrava di volerlo cedere neanche dopo il matrimonio di GianGaleazzo che nonostante i suoi 20 anni continuava a farsi dominare dallo zio. Il Moro credette di poter equiparare Isabella allo sposo e per tenerli entrambi lontani da Milano, assegnò loro per dimora il castello di Pavia. Isabella però alla gentilezza e alla modestia dell’educazione materna accoppiava la natura ardente meridionale e il sentimento di fierezza della sua dinastia, onde fu donna di carattere forte e altero, quasi superiore al suo sesso. Questa nobile figura di donna veniva a contrapporsi alla losca persona del Moro : astuto, intrigante, avido di potere e di gloria, calcolatore senza scrupoli, sadico dell’ordire tradimenti e sofferenze a danno altrui. Iniziò così fra i due una lotta che risulterà fatale per entrambi, una lotta aggravatasi ancor più dopo il matrimonio del Moro con Beatrice d’Este, poiché questa e non lei sembrava fosse duchessa di Milano e ancor più in seguito quando Isabella si accorse delle manovre del Moro per far nominare duca di Milano il figlio avuto da Beatrice. Infatti il 27 aprile 1497 il Moro donò il ducato di Bari al figlioletto Francesco, di tre anni, riservandosi l’usufrutto fino a che questi pervenisse ad età matura. Il 20 giugno dello stesso anno il re Federico firmava l’assenso a tale concessione. Il potere del Moro era ora al suo apice, eppure stava per subire un duro colpo : il successore di Carlo VIII, Luigi XII strinse con Venezia un’alleanza offensiva contro di lui. Quando si accorse di non avere forze sufficienti per arrestare gli eserciti francesi che avanzavano, pensò di fuggire. Ma prima ancora di fuggire, nel timore che in sua assenza il popolo di Milano proclamasse duca di Milano Francesco, figlio di Isabella, donò a questa il ducato di Bari spingendola a partire subito. Durante l’assenza del Moro da Milano, Isabella partì per Napoli con le figliolette Ippolita e Bona, ma poco più di un mese dal suo arrivo le giunse la notizia che Ludovico il Moro, entrato a Milano il 5 febbraio 1500 era stato nuovamente sconfitto e catturato dai francesi. Isabella cominciò ad interessarsi più da vicino al ducato di Bari. Anche a Napoli gli avvenimenti precipitarono poiché il re di Spagna Ferdinando il Cattolico stilava un contratto con Luigi XII per la spartizione del regno di Napoli. All’arrivo dei francesi Isabella si rifugiò a Ischia, come fece più tardi lo stesso Federico, dove morì la figlia Ippolita. Costretta quindi dalle circostanze, nel settembre del 1501 si recò finalmente a Bari, stabilendosi nel castello con la figlia Bona. Aveva travato un asilo di pace e una terra di governo. Quella che fino ad allora era stata una vana aspirazione per il ducato di Milano, ora era realtà seppure in un piccolo ducato come quello di Bari. Isabella aveva avuto aiuto dal re Federico, suo zio, prima che egli partisse per l’esilio in Francia, il diploma di conferma del ducato di Bari. La sua situazione era però del tutto precaria : la donazione del ducato fatta dal Moro era illegale perché padrone del ducato era il figlio secondogenito di questi, Francesco Sforza, e la stessa conferma del re di Napoli non era valida oltre che per questo motivo, anche perché rilasciata quando era già spodestato. Inoltre i nuovi conquistatori del regno, Francesi e Spagnoli, erano suoi nemici : i primi le avevano tolto il ducato di Milano mentre i secondi avevano tradito la causa degli Aragonesi. E poi il feudo di Bari dipendeva dagli Spagnoli, poiché nella spartizione del Napoletano, la Puglia era toccata alla Spagna.

Pertanto per amore del suo ducato Isabella si decise a far atto di sottomissione al comandante degli Spagnoli, il famoso Consalvo da Cordoba, nonostante il suo carattere fiero ed altero.

Il Consalvo in nome del re di Spagna si mostrò deferente verso Isabella e le diede licenza di prendere possesso del ducato. Con il feudo pugliese Isabella era venuta in possesso anche di altri due piccoli feudi in Calabria e a Taranto. Poco si sa delle accoglienze della Terra di Bari alla nuova sovrana, sappiamo però dai documenti che ogni volta che Isabella tornava da Napoli, un corteo di cavalieri le andava incontro a Barletta e quindi più trionfale sarà stata la prima accoglienza fattale dai Baresi. Una medaglia rinvenuta un secolo fa reca l’inscrizione :"Isabella Aragonia Dux MDI" che significa "Isabella d’Aragona Duchessa 1501". La medaglia è quindi dell’anno dell’ingresso di Isabella a Bari e rappresenta la nuova duchessa "come si conveniva nel tempo del dolore ; un semplice velo che dal capo scende al seno, lascia trasparire il bel profilo di un mietissimo volto".

Isabella viene infatti descritta dagli storici quale donna di eccezionale bellezza, che i celebri pittori (tra i quali Leonardo da Vinci) cercarono di ritrarre. Inoltre appena stabilitasi nel castello di Bari, non mancò di circondarsi di umanisti, medici e letterati.

Ella venne a Bari con diverse famiglie lombarde, le quali affezionate a lei, vollero seguirla nella nuova patria. Alcune di queste famiglie si stabilirono in Modugno, tra i più noti ricordiamo : Francesco Cornale di Crema con i due figli Amedeo e Girolamo ; le famiglie Cesena, Cataneo (poi Capitaneo) e Scarli, venute a Bari con Isabella e che si trasferirono a Modugno al tempo della regina Bona.

Isabella fu saggia e magnanima nel governo del suo nuovo ducato, nel quale profuse le sue grandi doti di cuore e di intelligenza. Ella portò da Milano nel piccolo feudo di Bari quello spirito di rinnovamento amministrativo e di fervore di opere pubbliche che è proprio del ducato Sforzesco.

Nell’amministrazione vigilò sui pubblici ufficiali onde non commettessero soprusi e speculazioni. Aveva un alto senso della giustizia e pubblicò una pandette per frenare i guadagni illeciti degli amministratori. Difese il privilegio del suo ducato di avere gratuitamente il sale contro gli ufficiali spagnoli addetti alle regie saline di Puglia, i quali spesso si opponevano. Sostenne i diritti dei cittadini del ducato nelle cause con i paesi vicini (specie Gioia e Bitonto) e andò incontro ai bisogni delle popolazioni sgravando da dazi i contadini che macinavano le proprie olive.

Si adoperò per la concordia tra i cittadini promovendo la fusione tra le famiglie locali e le numerose famiglie milanesi incoraggiando dei matrimoni tra esse. Per favorire l’istruzione, istituì una Commissione che sovrintendesse all’insegnamento pubblico e ottenne che ogni convento destinasse due frati per l’istruzione del popolo, agli insegnati concesse molte agevolazioni, tra cui, oltre nell’aumento dello stipendio, l’alloggio gratuito e le franchigie e risale ai suoi tempi la fondazione dell’Accademia degli Incogniti. Per incrementare il commercio allargò le facilitazioni concesse ai milanesi anche a cittadini di altre città, si che da ogni regione si veniva a commerciare a Bari.

Inoltre Isabella dedicò particolare attenzioni ad opere pubbliche e culturali tanto che in questo periodo venne stampato in Bari il primo libro, segno del livello di cultura raggiunto nel ducato. Anche se con scarsi mezzi di cui disponeva, si dedicò all’ampliamento del molo di Bari con grande vantaggio per il commercio, all’isolamento completo di Bari mediante un grande canale collegato con il mare, dal molo di San Nicola sin dietro il castello, il cui tracciato doveva corrispondere all’attuale corso Vittorio Emanuele. Anche se quest’ultimo progetto non fu portato a termine, forse per problemi finanziari, neanche dalla figlia Bona, fu cominciato il canale dopo il bacino costruito fuori le mura. Nel 1567 una bufera ostruì il canale iniziato e le acque formarono un piccolo lago, cui rimase il nome di "mare Isabella". Non si conosce molto delle reali intenzioni della duchessa. Il Beatillo commentava che il progetto di "porre in isola" Bari, mirava ad ampliare la città "quanto vi era di spatio delle muraglie del castello e della stessa città, fino all’acque" ; ma il Calefati correggeva la sua interpretazione spiegando che si trattava di un canale di deflusso delle acque che "allagavano e rendevano impraticabili le vie".

Petroni e Perotti invece affermavano rispettivamente il primo che l’intervento mirava al risanamento delle saline in abbandono, il secondo che si trattò di opere di contenimento al Picone ; Masellis ipotizzava ulteriormente che si trattasse di un’opera di difesa militare della città.

Fece rifare quasi completamente il suo castello di Bari, munendolo di quattro bastioni e restaurando le due alte torri, mentre all’interno veniva rivestito con grande sfarzo, con sale riccamente addobbate e con tutti i comfort di un palazzo principesco. Isabella dunque con il suo illuminato ed energetico governo fece rifiorire il ducato di Bari, dando impulso ad ogni attività nella vita del piccolo Stato e se il programma di opere pubbliche favorì quasi esclusivamente il capoluogo, il rinnovamento amministrativo fu di gran vantaggio anche alle altre due terre del ducato : Modugno e Palo.