Nel '500 l'architettura militare in Puglia presenta un grande sviluppo dovuto soprattutto alla minaccia turca, mentre più in generale la scoperta della polvere da sparo modifica con il sistema difensivo, la stessa architettura militare. Con il 1495 inizia per Monopoli un periodo nel quale la città passa più volte dal dominio veneziano a quello spagnolo che si conferma stabilmente nel 1529. In questo trentennio i visitatori di entrambi i regni continuano a sollecitare sempre più insistentemente la realizzazione di una fortezza a difesa della città. Nel 1544 il Vice Re di Napoli Don Pedro de Toledo, da inizio probabilmente ai lavori per la costruzione del castello che viene ubicato intorno e sopra al piccolo fortilizio arroccato sulla porta di Punta Penna. Già nel 1547 è stato realizzato qualcosa, probabilmente il grande vano ad "L" del piano banchina. Certamente però, nel 1552 la costruzione cinquecentesca, è stata completata, compreso il bastione pentagonale aggiunto, per migliorare la difesa, alla facciata nord-est. Questa data è attesata anche dall'epigrafe, parzialmente leggibile, che accompagna lo stemma posto sul prospetto frontale del bastione. Il castello utilizza come ingresso la porta e il vano principale del fortilizio quattrocentesco, aumentandone notevolmente lo spessore del muro verso la città e riorganizzando lo spazio esterno del fossato con l'unica scalinata che da questo collega la costruzione con la città. Dal vano ingresso, collegato a destra con ciò che resta della chiesa, e a sinistra con i locali di servizio tra cui la cucina, si accede, attraverso l'unica porta civica inglobata, nel grande vano ad "L" probabile camera-dormitorio dei soldati. Da questo ambiente sale la lunga scala in tufo che collega con la piazza d'armi, oggi piano cortile, dove una serie di locali fungono da deposito per armi e munizioni. Alcuni spazi che rimangono racchiusi tra i muri delle preesistenze e quelli della nuova costruzione in corrispondenza dell'ala sud-est del castello vengono vengono adibiti a grande cisterna per la riserva idrica.